1Nożyczki, klej i kserokopiarka
- Restryktaza rozpoznaje krótką sekwencję, zwykle palindromową (czytaną od końca 5′ na obu niciach tak samo), i przecina DNA. Robi to tak, że powstają końce lepkie (jednoniciowe, komplementarne ogonki) albo tępe (cięcie prosto, bez ogonków). Przykład: EcoRI rozpoznaje GAATTC i tnie między G a A, zostawiając ogonki AATT.
- Ligaza DNA łączy fragmenty wiązaniami fosfodiestrowymi. Lepkie końce zespalają się łatwiej, bo ogonki pasują do siebie jak zamek.
- Polimeraza DNA syntetyzuje nową nić na matrycy. W PCR musi być termostabilna (np. Taq), żeby nie rozpadła się w ok. 95°C.
Restryktaza tnie, ligaza łączy, polimeraza buduje nową nić.
2Wektor i marker
- Wektor niesie gen do komórki biorcy. Najczęściej jest to plazmid, czyli mały kolisty DNA bakterii, z miejscem wprowadzenia genu (miejsca cięcia restryktaz) i markerem selekcyjnym, np. genem oporności na antybiotyk.
- Na podłożu z antybiotykiem przeżywają tylko bakterie, które plazmid przyjęły. To jak sito: nie oglądasz każdej komórki, tylko zostawiasz te z biletem wstępu.
Rolą markera selekcyjnego w plazmidzie jest
Gen oporności pozwala przeżyć na podłożu z antybiotykiem tylko transformantom.
To jedno z 8 pytań quizu. Rozwiąż cały quiz →
3Hybrydyzacja i analiza restrykcyjna
- Hybrydyzacja: sonda, czyli krótka znakowana nić DNA lub RNA (radioaktywnie albo fluorescencyjnie), łączy się z komplementarną sekwencją i pokazuje, gdzie ona jest.
- Analiza restrykcyjna: tniesz DNA restryktazą, a fragmenty rozdzielasz elektroforezą; powstaje wzór prążków. Mutacja, która niszczy miejsce cięcia, zmienia ten wzór.
- Przykład z liczbami: plazmid 6000 par zasad (pz) z dwoma miejscami cięcia po restryktazie daje dwa fragmenty, np. 2000 i 4000 pz (suma 6000 pz). Krótszy fragment biegnie dalej od studzienki do bieguna dodatniego.
Pisanie, że elektroforeza tnie DNA. Tnie restryktaza, a elektroforeza tylko rozdziela fragmenty według długości.
✎Ściąga: Enzymy, wektory i analiza DNA
Najważniejsze w pigułce – przeczytaj tuż przed kartkówką lub sprawdzianem.
- Restryktaza tnie, ligaza łączy, polimeraza buduje nową nić.
- Restryktaza rozpoznaje krótką sekwencję, zwykle palindromową (czytaną od końca 5′ na obu niciach tak samo), i przecina DNA. Robi to tak, że powstają końce lepkie (jednoniciowe, komplementarne ogonki) albo tępe (cięcie prosto, bez ogonków). Przykład: EcoRI rozpoznaje GAATTC i tnie między G a A, zostawiając ogonki AATT.
- Ligaza DNA łączy fragmenty wiązaniami fosfodiestrowymi. Lepkie końce zespalają się łatwiej, bo ogonki pasują do siebie jak zamek.
- Polimeraza DNA syntetyzuje nową nić na matrycy. W PCR musi być termostabilna (np. Taq), żeby nie rozpadła się w ok. 95°C.
- Wektor niesie gen do komórki biorcy. Najczęściej jest to plazmid, czyli mały kolisty DNA bakterii, z miejscem wprowadzenia genu (miejsca cięcia restryktaz) i markerem selekcyjnym, np. genem oporności na antybiotyk.
- Hybrydyzacja: sonda, czyli krótka znakowana nić DNA lub RNA (radioaktywnie albo fluorescencyjnie), łączy się z komplementarną sekwencją i pokazuje, gdzie ona jest.
- Analiza restrykcyjna: tniesz DNA restryktazą, a fragmenty rozdzielasz elektroforezą; powstaje wzór prążków. Mutacja, która niszczy miejsce cięcia, zmienia ten wzór.
?Quiz: powtórz przed kartkówką
8 pytań w stylu kartkówki i sprawdzianu. Odpowiedz w myślach, potem sprawdź odpowiedź. Rozwiąż quiz z wynikiem – każda odpowiedź ma wyjaśnienie.
Którą funkcję pełni restryktaza?
- ARozdziela fragmenty DNA według długości
- BŁączy fragmenty DNA wiązaniami fosfodiestrowymi
- CRozpoznaje krótką sekwencję i przecina DNA
- DSyntetyzuje nić DNA na matrycy
Sprawdź odpowiedź
Odpowiedź C: Rozpoznaje krótką sekwencję i przecina DNA – Restryktaza to nożyczki, a łączenie robi ligaza.
Do czego w klonowaniu genu służy ligaza?
- AKopiuje gen przed wstawieniem do plazmidu
- BWybiera bakterie, które przyjęły plazmid
- CTnie plazmid w wybranym miejscu
- DŁączy gen z plazmidem po cięciu restryktazą
Sprawdź odpowiedź
Odpowiedź D: Łączy gen z plazmidem po cięciu restryktazą – Ligaza zszywa cukrowo-fosforanowy szkielet w miejscu połączenia fragmentów.
Dlaczego w PCR stosuje się termostabilną polimerazę DNA?
- ANie potrzebuje starterów ani nukleotydów
- BSama rozdziela nici matrycy bez ogrzewania
- CRozpoznaje sekwencje palindromowe
- DWytrzymuje temperaturę ok. 95°C bez utraty aktywności
Sprawdź odpowiedź
Odpowiedź D: Wytrzymuje temperaturę ok. 95°C bez utraty aktywności – Zwykły enzym uległby denaturacji w etapie rozdzielania nici, a Taq nie.
Rolą markera selekcyjnego w plazmidzie jest
- Apołączenie plazmidu z genem
- Bumożliwienie wyboru komórek, które przyjęły plazmid
- Czwiększenie liczby kopii wstawionego genu
- Dprzecięcie DNA biorcy
Sprawdź odpowiedź
Odpowiedź B: umożliwienie wyboru komórek, które przyjęły plazmid – Gen oporności pozwala przeżyć na podłożu z antybiotykiem tylko transformantom.
Plazmid o długości 6000 pz cięto restryktazą i po elektroforezie zobaczono dwa prążki: 2000 pz i 4000 pz. Jaki wniosek jest poprawny?
- APlazmid ma trzy miejsca cięcia tej restryktazy
- BPlazmid ma jedno miejsce cięcia tej restryktazy
- CPlazmid nie ma miejsca cięcia tej restryktazy
- DPlazmid ma dwa miejsca cięcia tej restryktazy
Sprawdź odpowiedź
Odpowiedź D: Plazmid ma dwa miejsca cięcia tej restryktazy – Kolisty plazmid z jednym cięciem dałby jeden liniowy fragment 6000 pz, z dwoma dwa fragmenty.
Po elektroforezie fragmentów 500, 1500 i 3000 pz najdalej od studzienki znajdzie się
- Afragment 500 pz
- Bfragment 1500 pz
- Cfragment 3000 pz
- Dwszystkie w tej samej odległości
Sprawdź odpowiedź
Odpowiedź A: fragment 500 pz – Krótsze fragmenty łatwiej przeciskają się przez żel i wędrują dalej do bieguna dodatniego.
Dlaczego sonda wiąże się tylko z jedną sekwencją w badanym DNA?
- AJest komplementarna do tej sekwencji i tworzy z nią wiązania wodorowe
- BTnie DNA tylko w wybranym miejscu
- CMa dodatni ładunek i przyciąga ujemne DNA
- DJest białkiem rozpoznającym każdą sekwencję palindromową
Sprawdź odpowiedź
Odpowiedź A: Jest komplementarna do tej sekwencji i tworzy z nią wiązania wodorowe – O swoistości hybrydyzacji decyduje komplementarność zasad sondy i sekwencji docelowej.
Która sekwencja (nić czytana 5′→3′) jest palindromowa w sensie miejsca rozpoznawanego przez restryktazy?
- AGAATTC
- BGCCGTA
- CATGCAA
- DGGATCA
Sprawdź odpowiedź
Odpowiedź A: GAATTC – Komplementarna nić GAATTC czytana od 5′ też brzmi GAATTC, a w pozostałych sekwencjach nie.
Cały dział „Biotechnologia i inżynieria genetyczna”: ściąga i próbny sprawdzian →
Kartkówka albo sprawdzian już blisko?
Rozwiąż quiz z wynikiem i powtórz materiał na fiszkach. Każda odpowiedź ma wyjaśnienie, a postęp zapisuje się bez zakładania konta.