1PCR: etapy i liczby
- Rdzeń (istota PCR, elektroforeza, zastosowania) jest w III klasie, dz. 1.2. Tu pogłębienie.
- Cykl PCR ma trzy etapy: denaturacja (ok. 95°C, rozdzielenie nici przez rozerwanie wiązań wodorowych), przyłączenie starterów (ok. 50–65°C, startery wyznaczają początek i koniec kopiowanego odcinka) i wydłużanie (ok. 72°C, Taq dobudowuje nukleotydy do końca 3′ startera).
- Liczba kopii rośnie wykładniczo: N = N₀ · 2n, gdzie N – liczba cząsteczek po n cyklach, N₀ – liczba cząsteczek na początku, n – liczba cykli, 2 – podwojenie w każdym cyklu (w idealnych warunkach).
- Przykład. Dane: N₀ = 50, n = 8. Obliczenia: 28 = 256, N = 50 · 256 = 12 800. Odpowiedź: ok. 12 800 cząsteczek.
- Do reakcji potrzebne są: matryca DNA, dwa startery, nukleotydy (dNTP), termostabilna polimeraza DNA i bufor z jonami Mg²⁺.
Startery są potrzebne, bo polimeraza dobudowuje nukleotydy tylko do istniejącego końca 3′-OH.
2Elektroforeza
- DNA ma ładunek ujemny (grupy fosforanowe), więc w polu elektrycznym wędruje w żelu do anody (+). Krótsze fragmenty przeciskają się szybciej i lądują dalej od studzienki. Długość odczytujesz, porównując prążki ze wzorcem wielkości (fragmenty o znanej długości).
Dlaczego w PCR potrzebne są startery?
Startery wyznaczają początek powielanego odcinka i dają polimerazie koniec, od którego może zacząć.
To jedno z 8 pytań quizu. Rozwiąż cały quiz →
3Sekwencjonowanie metodą Sangera
- Do mieszaniny z matrycą, starterem i polimerazą dodaje się zwykłe nukleotydy i niewielką ilość terminatorów łańcucha (ddNTP). Każdy typ terminatora ma inną barwę fluorescencyjną i nie ma grupy 3′-OH, więc po jego wbudowaniu synteza się zatrzymuje.
- Powstają fragmenty o wszystkich długościach, każdy kończy się terminatorem. Elektroforeza rozdziela je co do jednego nukleotydu, a odczyt barw od najkrótszego do najdłuższego daje sekwencję nowej nici.
- Przykład: barwy kolejnych fragmentów G, A, T, T, C oznaczają nić 5′-GATTC-3′.
Przekonanie, że elektroforeza wyznacza sekwencję. Ona tylko rozdziela fragmenty; informacja jest w znakowanych terminatorach.
4Do czego to służy
- Diagnostyka chorób i identyfikacja patogenów (wirusy, bakterie, mutacje), ustalanie pokrewieństwa i kryminalistyka: profil DNA porównuje powtarzalne sekwencje. Zgodność profilu nie jest dowodem sama w sobie; wynik ocenia się statystycznie.
W sekwencjonowaniu Sangera barwy ostatnich nukleotydów kolejnych fragmentów od najkrótszego do najdłuższego to G, A, T, T, C. Jaka jest sekwencja syntetyzowanej nici od końca 5′?
Kolejność fragmentów od najkrótszego odpowiada kolejności nukleotydów od 5′, więc nić to GATTC.
To jedno z 8 pytań quizu. Rozwiąż cały quiz →
✎Ściąga: PCR, elektroforeza i sekwencjonowanie
Najważniejsze w pigułce – przeczytaj tuż przed kartkówką lub sprawdzianem.
- Startery są potrzebne, bo polimeraza dobudowuje nukleotydy tylko do istniejącego końca 3′-OH.
?Quiz: powtórz przed kartkówką
8 pytań w stylu kartkówki i sprawdzianu. Odpowiedz w myślach, potem sprawdź odpowiedź. Rozwiąż quiz z wynikiem – każda odpowiedź ma wyjaśnienie.
Jaka jest kolejność etapów jednego cyklu PCR?
- APrzyłączenie starterów, denaturacja, wydłużanie
- BWydłużanie, denaturacja, przyłączenie starterów
- CDenaturacja, przyłączenie starterów, wydłużanie
- DDenaturacja, wydłużanie, przyłączenie starterów
Sprawdź odpowiedź
Odpowiedź C: Denaturacja, przyłączenie starterów, wydłużanie – Najpierw trzeba rozdzielić nici, potem przyłączyć startery, a na końcu dobudować nić.
Z 50 cząsteczek matrycy po 8 idealnych cyklach PCR powstanie około
- A6 400 cząsteczek
- B400 cząsteczek
- C12 800 cząsteczek
- D3 200 cząsteczek
Sprawdź odpowiedź
Odpowiedź C: 12 800 cząsteczek – N = 50 · 28 = 50 · 256 = 12 800.
Co dzieje się w czasie denaturacji w PCR?
- APrzyłączenie starterów do matrycy
- BRozerwanie wiązań fosfodiestrowych w obu niciach
- CSynteza nowych nici przez polimerazę
- DRozerwanie wiązań wodorowych i rozdzielenie nici
Sprawdź odpowiedź
Odpowiedź D: Rozerwanie wiązań wodorowych i rozdzielenie nici – Wysoka temperatura rozdziela nici, nie rozcina ich szkieletu.
Dlaczego w PCR potrzebne są startery?
- ATną DNA w miejscu docelowym
- BRozdzielają nici matrycy
- CPolimeraza dobudowuje nukleotydy tylko do wolnego końca 3′-OH
- DDostarczają energii do syntezy
Sprawdź odpowiedź
Odpowiedź C: Polimeraza dobudowuje nukleotydy tylko do wolnego końca 3′-OH – Startery wyznaczają początek powielanego odcinka i dają polimerazie koniec, od którego może zacząć.
Dlaczego terminator łańcucha (ddNTP) przerywa syntezę w metodzie Sangera?
- ANie ma grupy 3′-OH, więc nie można dołączyć kolejnego nukleotydu
- BPrzecina nić matrycową
- CMa dodatkową grupę fosforanową, która blokuje matrycę
- DZastępuje starter
Sprawdź odpowiedź
Odpowiedź A: Nie ma grupy 3′-OH, więc nie można dołączyć kolejnego nukleotydu – Brak 3′-OH uniemożliwia powstanie wiązania z następnym nukleotydem.
W sekwencjonowaniu Sangera barwy ostatnich nukleotydów kolejnych fragmentów od najkrótszego do najdłuższego to G, A, T, T, C. Jaka jest sekwencja syntetyzowanej nici od końca 5′?
- ACTAAG
- BCTTAG
- CGAATC
- DGATTC
Sprawdź odpowiedź
Odpowiedź D: GATTC – Kolejność fragmentów od najkrótszego odpowiada kolejności nukleotydów od 5′, więc nić to GATTC.
Dlaczego DNA w elektroforezie wędruje do bieguna dodatniego?
- AŻel jest naładowany ujemnie
- BMa dodatni ładunek zasad azotowych
- CMa ujemny ładunek grup fosforanowych
- DJest przyciągany przez bufor
Sprawdź odpowiedź
Odpowiedź C: Ma ujemny ładunek grup fosforanowych – Ujemnie naładowany DNA porusza się w polu elektrycznym ku anodzie.
Profil DNA śladu z miejsca zdarzenia jest identyczny z profilem podejrzanego A i różny od profilu podejrzanego B. Który wniosek jest najlepiej uzasadniony?
- AZgodność profilu nie ma znaczenia dowodowego
- BAni A, ani B nie mogą być źródłem śladu
- CB jest wykluczony, a A jest zgodny ze śladem, ale prawdopodobieństwo trzeba ocenić statystycznie
- DA na pewno zostawił ślad, bo profile są zgodne
Sprawdź odpowiedź
Odpowiedź C: B jest wykluczony, a A jest zgodny ze śladem, ale prawdopodobieństwo trzeba ocenić statystycznie – Różny profil wyklucza B, a zgodność z A zawęża krąg osób, ale nie daje pewności.
Cały dział „Biotechnologia i inżynieria genetyczna”: ściąga i próbny sprawdzian →
Kartkówka albo sprawdzian już blisko?
Rozwiąż quiz z wynikiem i powtórz materiał na fiszkach. Każda odpowiedź ma wyjaśnienie, a postęp zapisuje się bez zakładania konta.